На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. ! Чтобы не образовалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его
Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру
Микроскопируют в темном поле при увеличении объектива 40Х
Препарат можно поместить во влажную камеру для предохранения от высыхания
Метод висячей капли
Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло, вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина (рис. № 10)
На покровное стекло наносят каплю культуры и осторожно накрывают покровное стекло стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре
Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время
Микроскопия сначала при увеличении 8Х. Находят край капли, а затем переводят на большое увеличение 40Х (рис. № 11).
Рис. №10 . Техника приготовления препарата висячая капля
Рис. №11 . Лептоспира в темном поле
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №6
Зачетное занятие с замером навыков по теме:
«Морфология микроорганизмов»
Перечень манипуляций к зачету:
Подготовить препарат и окрасить его по методу Грама. Значение метода
Подготовить препарат и окрасить его по методу Ожешко. Значение метода
Подготовить препарат и окрасить его по методу Бурри-Гинса. Значение метода
Подготовить препарат, окрасив его по методу Циля-Нильсена (1999г). Значение метода
Подготовить препарат висячая капля, значение методики
Подготовить препарат раздавленная капля, значение методики
Промикроскопировать готовые препараты, окрашенные различными методами: по Граму, Ожешко, Бурри-Гинсу, Циля-Нильсену.
Вопросы к зачету:
Назовите основные формы бактериальных клеток,
Перечислите основные и дополнительные структуры прокариотической клетки, их функции,
Укажите состав и строение жгутиков, группы бактерий по расположению жгутиков,
Назовите строение и функции нуклеоида у прокариот,
Укажите, что собой представляет спора и ее значение для бактерий, расположение спор в клетке (примеры микробов).
Тестовые задания для самоконтроля
1. Расставьте этапы приготовления препарата в нужном порядке:
а) окрашивание
б) фиксация
в) приготовление мазка
г) высушивание
2. Укажите соответствие между возбудителем и методом его окраски:
стафилококк а) по Граму
микобактерия туберкулеза б) Циля - Нильсену
пневмококк в) Бурри - Гинсу
бацилла сибирской язвы г) Ожешко
3. Простой метод окраски:
а) по Нейссеру
б) метиленовым синим
в) по Граму
г) по Романовскому - Гимзе
4. Хранителем наследственной информации у прокариот является:
а) нуклеоид
в) включения
г) капсула
5. Окраска по методу Бурри отличается от метода Бурри-Гинса:
а) по времени окрашивания
б) отсутствия фуксина Пфейффера
в) разные разведения туши
г) мазок фиксируется в пламени горелки
6. При окраске препарата методом Циля-Нильсена (инструкция 1999г.) используется:
в) 5% Н 2 SО 4
г) 25% Н 2 SО 4
7. К спорообразованию способны:
а) стафилококки
б) бациллы
в) сарцины
г) кишечная палочка
8. В методике окраски по Бурри-Гинсу используется черная тушь, разведенная в
9. Укажите соответствие:
Метод окраски: Цель метода:
метод Ожешко а) обнаружение капсулы
метод Бурри б) определение кислотоустойчивости
метод Циля-Нильсена в) отношение к Граму
4. метод Грама г) определение споры
10. При изучении подвижности используется микроскопия: а) фазово-контрастная
б) темнопольная
в) электронная
г) люминисцентная
11. Гонококки - это шаровидные бактерии, в мазках выглядят как:
а) диплококки
б) сарцины
в) микрококки
г) тетракокки
12. При окраске по Граму используется следующий краситель:
а) фуксин Циля
б) метиленовый синий
в) бриллиантовый зеленый
г) генциановый фиолетовый
13. Спору у бактерий можно выявить, окрасив препарат:
а) метиленовым синим
б) методом Ожешко
в) методом Грама
г) по Бурри-Гинсу
14. Флагеллин - это белок, входящий в состав:
а) оболочки
б) капсулы
в) цитоплазмы
г) жгутиков
15. Укажите соответствие:
Вид микроскопии: Цель применения:
1) Световая обычная микроскопия а) для изучения живых неокрашенных
препаратов
2)Фазово-контрастная микроскопия б) для изучения окрашенных препаратов
16. Перетрихи - имеют следующее расположение жгутиков на клетке:
а) по всей поверхности
б) на обоих концах
в) пучок на одном из концов
г) один жгутик на конце клетки
17. Виды фиксации:
1) физический а) пламя горелки, б) смесь Никифорова,
2) химический в) ацетон, г) спирт
18. Предметное стекло с лункой используется:
а) в методе Циля-Нильсена
б) изучение подвижности
в) изучения на наличие капсулы
г) при обнаружении споры
19. Дополнительной структурой бактерий является:
а) нуклеоид
в) капсула
г) рибосомы
20. Препарат из нативного материала готовится при окраске:
б) Бурри - Гинса
в) Ожешко
г) Циля-Нильсена
21. Бактерии штопорообразной формы называют:
а) спирохеты
б) спириллы
в) вибрионы
г) бруцеллы
22. Негативные методы окраски используются при методе:
а) Бурри-Гинса
б) Циля-Нильсена
г) Ожешко
д) Нейссера
23. В состав клеточной стенки бактерий входит:
а) крахмал
б) муреин
в) альбумин
24. Методы изучения микроорганизмов:
а) серологические
б) бактериологические
в) аллергические
г) все ответы верны
ОТВЕТЫ НА ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ
2 – б, в, г
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Алешукина А.В. Медицинская микробиология: Учебное пособие. – Ростов н/Д: Феникс, 2003 г.
Бакулина Н.А., Краева Э.Л. Микробиология. М., «Медицина», 1976
Микробиология /Под ред. Ф.К. Черкес. – М.: Медицина, 1986 г.
Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии: Учебник / А.А.Воробьев, Ю.С. Кривошеин, А.С. Быков и др. Под ред. А.А. Воробьева и Ю.С. Кривошеина. – М.: Мастерство; Высшая школа, 2001 г.
Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.В. Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии: Учебное пособие для средних специальных медицинских учебных заведений. – Ростов н/Д: Феникс, 2002 г.
Руководство для малого практикума по микробиологии, П.А.Чиров, З.И.Остроухова, Е.И.Тихомирова, Изд-во СГУ, 1998 г.
Сбойчаков В.Б. Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований: учебник для средних медицинских учебных заведений / В.Б. Сбойчаков. – СПб.: СпецЛит, 2007г.
ПРИЛОЖЕНИЕ №1
Техника безопасности в кабинете (лаборатории) микробиологии
Правила работы со спиртовкой
Заправленную спиртовку хранят плотно закрытой притертым колпачком, чтобы предотвратить испарение спирта с фитиля
При зажигании спиртовки нужно снять колпачок и поджечь фитиль спичкой. При этом нельзя сдвигать держатель фитиля, т.к. пламя проскочит внутрь спиртовки, что вызовет сильную вспышку и разбрызгивание горящего спирта
Нельзя зажигать спиртовку от другой уже горящей спиртовки, т.к. при этом может сдвинуться держатель фитиля и вылиться спирт
Нельзя дуть на пламя, чтобы погасить спиртовку. Для этого следует аккуратно закрыть спиртовку колпачком.
Необходимо следить за тем, чтобы спиртовка не перегревалась. Это ведет к испарению спирта и опасности взрыва
При длительном нагревании лучше пользоваться двумя спиртовками
Не следует при работе наклонять голову над спиртовкой, т.к. при накоплении паров спирта под держателем фитиля может происходить самопроизвольное вспыхивание
Правила пользования ручным химическим пенным огнетушителем
ОХП -10
В случае возникновения пожара необходимо:
Для приведения огнетушителя в действие – ручку верхней части корпуса поворачивают на 180 о и переворачивают огнетушитель вверх дном
Струю пены следует направлять не в центр пламени, а под минимальным углом к поверхности горения в нижнюю часть пламени, последовательно сбивая и оттесняя его от краев к центру
При тушении огня ОХП – 10 необходимо обесточить все помещения с помощью рубильника, т.к. химическая пена в составе огнетушителя обладает высокой электропроводностью
ОХП – 10 применяют для тушения крупных очагов возгорания, когда другие средства малоэффективны
Правила работы с живой культурой
Правила работы с нагревательными приборами
При работе с электроплитками склянки с огнеопасными жидкостями следует держать на расстоянии не менее 1 м от рабочего места
Работать на неисправном и незаземленном оборудовании категорически запрещается
При временном прекращении работы, даже на непродолжительное время, источники нагревания выключать
Нельзя нагревать толстостенную стеклянную посуду, мерную посуду, неградуированные цилиндры. Фарфоровую посуду (стаканы, выпарительные чашки) можно нагревать на открытом пламени или водяной бане
Стеклянную посуду с плоским дном нагревать на открытом пламени или электроплитке с открытой спиралью нельзя
ПРИЛОЖЕНИЕ №2
Правила работы в микробиологической лаборатории
Работа с заразным материалом требует особой тщательности и соблюдения правил личной и общественной безопасности при ее выполнении
В помещении лаборатории необходимо строго соблюдать чистоту и порядок. На рабочем столе не должно быть никаких посторонних предметов. Запрещается прием пищи, излишние разговоры, суета
Работа обязательно проводится в халате, шапочке, сменной обуви
Каждый студент имеет в лаборатории свое постоянное рабочее место
Материал для работы принимает дежурный по бригаде у лаборанта и раздает студентам в присутствии преподавателя
В начале занятия необходимо записать в тетрадь дату, номер, тему занятия, план выполняемой работы. В процессе работы делаются записи и зарисовки в дневник
Все предметы, использованные при работе с живой культурой, обезвреживаются
В конце занятия студенты сдают весь материал дежурному по бригаде, а он лаборанту или преподавателю
В конце занятия студент должен:
Привести в порядок свое рабочее место
Сдать микроскоп, материал дежурному
Вымыть руки дез. раствором, а затем мылом
Представить преподавателю для подписи дневник
Анна Вадимовна Палиенко
Руководство для студентов отделения 060110 «Лабораторная диагностика»
по курсу «Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований»
раздел «Морфология микроорганизмов»
На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. ! Чтобы не образовалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его
Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру
Микроскопируют в темном поле при увеличении объектива 40Х
Препарат можно поместить во влажную камеру для предохранения от высыхания
Метод висячей капли
Микроскопия сначала при увеличении 8Х. Находят край капли, а затем переводят на большое увеличение 40Х (рис. № 11).
Рис. №10 . Техника приготовления препарата висячая капля
Рис.
№11
.
Лептоспира в темном поле
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №6
Зачетное занятие с замером навыков по теме:
«Морфология микроорганизмов»
Перечень манипуляций к зачету:
Подготовить препарат и окрасить его по методу Грама. Значение метода
Подготовить препарат и окрасить его по методу Ожешко. Значение метода
Подготовить препарат и окрасить его по методу Бурри-Гинса. Значение метода
Подготовить препарат, окрасив его по методу Циля-Нильсена (1999г). Значение метода
Подготовить препарат висячая капля, значение методики
Подготовить препарат раздавленная капля, значение методики
Промикроскопировать готовые препараты, окрашенные различными методами: по Граму, Ожешко, Бурри-Гинсу, Циля-Нильсену.
Вопросы к зачету:
Назовите основные формы бактериальных клеток,
Перечислите основные и дополнительные структуры прокариотической клетки, их функции,
Укажите состав и строение жгутиков, группы бактерий по расположению жгутиков,
Назовите строение и функции нуклеоида у прокариот,
Укажите, что собой представляет спора и ее значение для бактерий, расположение спор в клетке (примеры микробов).
Тестовые задания для самоконтроля
1. Расставьте этапы приготовления препарата в нужном порядке:
а) окрашивание
б) фиксация
в) приготовление мазка
г) высушивание
2. Укажите соответствие между возбудителем и методом его окраски:
стафилококк а) по Граму
микобактерия туберкулеза б) Циля - Нильсену
пневмококк в) Бурри - Гинсу
бацилла сибирской язвы г) Ожешко
3. Простой метод окраски:
а) по Нейссеру
б) метиленовым синим
в) по Граму
г) по Романовскому - Гимзе
4. Хранителем наследственной информации у прокариот является:
а) нуклеоид
в) включения
г) капсула
5. Окраска по методу Бурри отличается от метода Бурри-Гинса:
а) по времени окрашивания
б) отсутствия фуксина Пфейффера
в) разные разведения туши
г) мазок фиксируется в пламени горелки
6. При окраске препарата методом Циля-Нильсена (инструкция 1999г.) используется:
в) 5% Н 2 SО 4
г) 25% Н 2 SО 4
7. К спорообразованию способны:
а) стафилококки
б) бациллы
в) сарцины
г) кишечная палочка
8. В методике окраски по Бурри-Гинсу используется черная тушь, разведенная в
9. Укажите соответствие:
Метод окраски: Цель метода:
метод Ожешко а) обнаружение капсулы
метод Бурри б) определение кислотоустойчивости
метод Циля-Нильсена в) отношение к Граму
4. метод Грама г) определение споры
10. При изучении подвижности используется микроскопия: а) фазово-контрастная
б) темнопольная
в) электронная
г) люминисцентная
11. Гонококки - это шаровидные бактерии, в мазках выглядят как:
а) диплококки
б) сарцины
в) микрококки
г) тетракокки
12. При окраске по Граму используется следующий краситель:
а) фуксин Циля
б) метиленовый синий
в) бриллиантовый зеленый
г) генциановый фиолетовый
13. Спору у бактерий можно выявить, окрасив препарат:
а) метиленовым синим
б) методом Ожешко
в) методом Грама
г) по Бурри-Гинсу
14. Флагеллин - это белок, входящий в состав:
а) оболочки
б) капсулы
в) цитоплазмы
г) жгутиков
15. Укажите соответствие:
Вид микроскопии: Цель применения:
1) Световая обычная микроскопия а) для изучения живых неокрашенных
препаратов
2)Фазово-контрастная микроскопия б) для изучения окрашенных препаратов
16. Перетрихи - имеют следующее расположение жгутиков на клетке:
а) по всей поверхности
б) на обоих концах
в) пучок на одном из концов
г) один жгутик на конце клетки
17. Виды фиксации:
1) физический а) пламя горелки, б) смесь Никифорова,
2) химический в) ацетон, г) спирт
18. Предметное стекло с лункой используется:
а) в методе Циля-Нильсена
б) изучение подвижности
в) изучения на наличие капсулы
г) при обнаружении споры
19. Дополнительной структурой бактерий является:
а) нуклеоид
в) капсула
г) рибосомы
20. Препарат из нативного материала готовится при окраске:
б) Бурри - Гинса
в) Ожешко
г) Циля-Нильсена
21. Бактерии штопорообразной формы называют:
а) спирохеты
б) спириллы
в) вибрионы
г) бруцеллы
22. Негативные методы окраски используются при методе:
а) Бурри-Гинса
б) Циля-Нильсена
г) Ожешко
д) Нейссера
23. В состав клеточной стенки бактерий входит:
а) крахмал
б) муреин
в) альбумин
24. Методы изучения микроорганизмов:
а) серологические
б) бактериологические
в) аллергические
г) все ответы верны
ОТВЕТЫ НА ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ
2 – б, в, г
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Алешукина А.В. Медицинская микробиология: Учебное пособие. – Ростов н/Д: Феникс, 2003 г.
Бакулина Н.А., Краева Э.Л. Микробиология. М., «Медицина», 1976
Микробиология /Под ред. Ф.К. Черкес. – М.: Медицина, 1986 г.
Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии: Учебник / А.А.Воробьев, Ю.С. Кривошеин, А.С. Быков и др. Под ред. А.А. Воробьева и Ю.С. Кривошеина. – М.: Мастерство; Высшая школа, 2001 г.
Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.В. Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии: Учебное пособие для средних специальных медицинских учебных заведений. – Ростов н/Д: Феникс, 2002 г.
Руководство для малого практикума по микробиологии, П.А.Чиров, З.И.Остроухова, Е.И.Тихомирова, Изд-во СГУ, 1998 г.
Сбойчаков В.Б. Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований: учебник для средних медицинских учебных заведений / В.Б. Сбойчаков. – СПб.: СпецЛит, 2007г.
ПРИЛОЖЕНИЕ №1
Техника безопасности в кабинете (лаборатории) микробиологии
Правила работы со спиртовкой
Заправленную спиртовку хранят плотно закрытой притертым колпачком, чтобы предотвратить испарение спирта с фитиля
При зажигании спиртовки нужно снять колпачок и поджечь фитиль спичкой. При этом нельзя сдвигать держатель фитиля, т.к. пламя проскочит внутрь спиртовки, что вызовет сильную вспышку и разбрызгивание горящего спирта
Нельзя зажигать спиртовку от другой уже горящей спиртовки, т.к. при этом может сдвинуться держатель фитиля и вылиться спирт
Нельзя дуть на пламя, чтобы погасить спиртовку. Для этого следует аккуратно закрыть спиртовку колпачком.
Необходимо следить за тем, чтобы спиртовка не перегревалась. Это ведет к испарению спирта и опасности взрыва
При длительном нагревании лучше пользоваться двумя спиртовками
Не следует при работе наклонять голову над спиртовкой, т.к. при накоплении паров спирта под держателем фитиля может происходить самопроизвольное вспыхивание
Правила пользования ручным химическим пенным огнетушителем
ОХП -10
В случае возникновения пожара необходимо:
Для приведения огнетушителя в действие – ручку верхней части корпуса поворачивают на 180 о и переворачивают огнетушитель вверх дном
Струю пены следует направлять не в центр пламени, а под минимальным углом к поверхности горения в нижнюю часть пламени, последовательно сбивая и оттесняя его от краев к центру
При тушении огня ОХП – 10 необходимо обесточить все помещения с помощью рубильника, т.к. химическая пена в составе огнетушителя обладает высокой электропроводностью
ОХП – 10 применяют для тушения крупных очагов возгорания, когда другие средства малоэффективны
Правила работы с живой культурой
Правила работы с нагревательными приборами
При работе с электроплитками склянки с огнеопасными жидкостями следует держать на расстоянии не менее 1 м от рабочего места
Работать на неисправном и незаземленном оборудовании категорически запрещается
При временном прекращении работы, даже на непродолжительное время, источники нагревания выключать
Нельзя нагревать толстостенную стеклянную посуду, мерную посуду, неградуированные цилиндры. Фарфоровую посуду (стаканы, выпарительные чашки) можно нагревать на открытом пламени или водяной бане
Стеклянную посуду с плоским дном нагревать на открытом пламени или электроплитке с открытой спиралью нельзя
ПРИЛОЖЕНИЕ №2
Правила работы в микробиологической лаборатории
Работа с заразным материалом требует особой тщательности и соблюдения правил личной и общественной безопасности при ее выполнении
В помещении лаборатории необходимо строго соблюдать чистоту и порядок. На рабочем столе не должно быть никаких посторонних предметов. Запрещается прием пищи, излишние разговоры, суета
Работа обязательно проводится в халате, шапочке, сменной обуви
Каждый студент имеет в лаборатории свое постоянное рабочее место
Материал для работы принимает дежурный по бригаде у лаборанта и раздает студентам в присутствии преподавателя
В начале занятия необходимо записать в тетрадь дату, номер, тему занятия, план выполняемой работы. В процессе работы делаются записи и зарисовки в дневник
Все предметы, использованные при работе с живой культурой, обезвреживаются
В конце занятия студенты сдают весь материал дежурному по бригаде, а он лаборанту или преподавателю
В конце занятия студент должен:
Привести в порядок свое рабочее место
Сдать микроскоп, материал дежурному
Вымыть руки дез. раствором, а затем мылом
Представить преподавателю для подписи дневник
Анна Вадимовна Палиенко
Руководство для студентов отделения 060110 «Лабораторная диагностика»
к практическим занятиям
по курсу «Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований»
раздел «Морфология микроорганизмов»
Приготовление прижизненных (нативных) препаратов.
Культуры для приготовления препарата.
Материалы для исследования и техника взятия
Вопросы для рассмотрения
1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под редакцией Егорова Н.С. МГУ, М. 1995г. Стр. 81-97, 20-28.
2. Коротяев А.И., Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. «Спец. литература». Санкт-Петербург, 1998. Стр. 14-18.
3. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. «Колос», М. 1972. Стр. 5-23.
ТЕМА: Приготовление микроскопических препаратов и их окраска.
1. Приготовление прижизненных (нативных) препаратов.
2. Приготовление мазков и их фиксация.
3. Красители, используемые в микробиологии.
4. Простые и сложные методы окраски.
Задание для выполнения лабораторной работы
1. Приготовить фиксированный препарат из молодой культуры дрожжей, окрасить его в течение 2-3 мин метиленовым синим и микроскопировать без иммерсии.
2. Приготовить фиксированный препарат из почвенной суспензии, окрасить по методу Грама, микроскопировать его и зарисовать.
3. Выполнить схематическое изображение клеточной стенки грамотрицательных и грамположительных прокариот.
Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей, обоженной в пламени спиртовки или стерильной пипеткой.
Пробирку с бактериальной культурой берут в левую руку, а петлю за петледержатель в правую. Правой рукой вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, зажимая ее между мизинцем и ладонью, а края пробирки обжигают в пламени спиртовки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, после чего легким скользящим движением берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и ватную пробирку и закрывают пробирку. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пламени спиртовки.
Для исследования живых клеток микроорганизмов применяют методы «раздавленной и висячей капли». В обоих случаях возможно окрашивание объекта “прижизненными” красителями – “витальная” окраска.
На чистое предметное стекло наносят каплю воды. В каплю вносят культуру и смешивают с водой. Накрывают каплю покровным стеклом так, чтобы не образовались пузырьки воздуха. Стеклянной палочкой прижимают покровное стекло к предметному. Капля должна быть небольшой, не выходящей за края покровного стекла, но если суспензия попала за край - удаляют фильтровальной бумагой. Микроскопируют препарат с объективом 40Х. Метод удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, а также просмотра крупных объектов - плесневых грибов, дрожжей. Применяют при изучении запасных веществ клетки. Метод “висячей” капли – используются для длительных наблюдений за клетками микроорганизмов. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь её дна или края. Для микроскопии вначале используют малый сухой объектив 8Х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают иммерсионный объектив.
Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микроорганизмов вносят в каплю раствора метиленового синего или нейтрального красного в концентрациях от 0,001 до 0,00001%. Затем готовят препарат по одному из выше указанных методов и микроскопируют. После микроскопии препараты, «раздавленной» или «висячей» капли опускают в дезинфицирующий раствор.
Методика приготовления препарата:
· на середину предметного стекла наносят каплю бульонной культуры вульгарного протея. Каплю осторожно покрывают покровным стеклом, не допуская образования между стеклами пузырьков воздуха;
· препарат микроскопируют сухой системой, с использованием объектива х40. Оптика микроскопа должна быть очень чисто протерта, конденсор слегка опущен, а его диафрагма прикрыта с целью затемнения поля зрения.
· протей является перитрихом, передвигается в поле зрения беспорядочно. Важно не спутать характер его движения с пассивным перемещением в результате броуновского движения - беспорядочного колебания клеток.
4. Изучение подвижности протея (Proteus vulgaris) в препарате «висячая капля» с использованием фазово-контрастной микроскопии (демонстрация). Препарат висячей капли готовят, нанося в центр покровного стекла каплю исследуемого материала. Предметное стекло с лункой, края которой смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. После этого препарат переворачивают покровным стеклом вверх; капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. При микроскопии сначала используют объектив «малого» увеличения (х8) для нахождения края капли, после чего определяют подвижность бактерий с помощью объектива «большого» увеличения (х40) или иммерсионной микроскопии.
5. Морфология боррелий – возбудителей возвратного тифа (Borrelia recurrentis). Мазок из крови больного возвратным тифом (демонстрация). Окраска по Романовскому - Гимза. Краситель состоит из смеси азура-2 (продукт окисления метиленового синего) и эозина. Среди эритроцитов заметны тонкие лиловые удлиненные спирохеты, образующие до 9 крупных неравномерных завитков.
6. Морфология возбудителя сифилиса (Treponema pallidum). Окраска по Бурри (тушевой препарат). На темном фоне видны бесцветные трепонемы с 8 - 12 равномерными завитками.
7. Морфология и подвижность лептоспир - Leptospira interrogans. Темнопольная микроскопия (демонстрация). Представители этого рода имеют тонкие частые неглубокие завитки и обладают своеобразным движением, во время которого концы вращаются под углом к основной части тела. В стадии покоя имеют форму крючка. В темнопольном микроскопе используются специальные конденсоры (параболоид-конденсор с затемнением в центре и внутренней зеркальной поверхностью для отражения лучей света, либо кардиоид-конденсор, в котором лучи света отражаются сначала от выпуклой поверхности, а затем от вогнутой). Темнопольные конденсоры создают эффект бокового освещения, в результате чего на темном фоне видны светящиеся микроорганизмы. Морфология спирохет представлена на рис. 20.
8. Морфология риккетсий – возбудителей эпидемического сыпного тифа (Rickettsia provazeki).Окраска по Здродовскому. Методика окраски:
· Окраска мазка фуксином Циля в течение 5 минут.
· Промывание водой.
· Обработка мазка 0,01% раствором хлористоводородной кислоты.
· Промывание водой.
· Окраска метиленовым синим в течение 1 минуты.
· Промывание водой, высушивание, микроскопия. Риккетсии, окрашенные по этому методу, выглядят в виде мелких полиморфных микроорганизмов рубиново-красного цвета.
9. Хламидии (Chlamidia trachomatis) в мазках из уретры больных урогенитальным хламидиозом (внутри - и внеклеточное расположение). Демонстрационный препарат, окраска по Романовскому-Гимза.
10. Актиномицеты в материале от больного актиномикозом (окраска по Романовскому-Гимза). Зарисовать типичные для этого заболевания друзы актиномицетов, отметить лучистую структуру актиномицетов.
Тема 4. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ. АСЕПТИКА, АНТИСЕПТИКА, ДЕЗИНФЕКЦИЯ, СТЕРИЛИЗАЦИЯ. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. МЕТОДЫ И ЭТАПЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ
Испытуемую суточную бульонную культуру бактерий в количестве 0,5 мл вносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45° С 0,7% мясо-пептонным агаром, перемешивают и равномерно распределяют по поверхности 2% мясо-пептонного агара в чашке Петри.
После застывания агара чашку слегка подсушивают в термостате, затем стеклянное дно чашки делят на квадраты, надписывают номера (или названия) фагов, которые будут использоваться для типирования. Переворачивают чашку, приоткрывают крышку и на обозначенные квадраты пастеровской пипеткой наносят по одной капле соответствующих надписи фагов.
После суточной инкубации просматривают чашку, отмечая те квадраты, в которых имеется лизис бактерий.
Фаготип бактериальной культуры определяется тем типом (типами) фага, который вызывает ее лизис.
Занятие № 6
Генетика бактерий Изучение бактерий в живом состоянии
Приготовление препарата по методу “раздавленной” капли и его микроскопия.
Приготовление препаратов для изучения микроорганизмов в живом состоянии.
Метод «висячей» капли. Используют стекла с лункой и покровные стекла. Края покровного стекла смазывают вазелином, а в центр наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло лункой вниз прижимают к покровному стеклу, так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Используя малый сухой объектив 8х, находят край капли, затем устанавливают объектив 40х и микроскопируют.
Метод «раздавленной» капли.
На поверхность чистого предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой и не выходить за края покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40х или 100х (с иммерсией).
Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микробов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем приготавливают препарат «висячей» или «раздавленной» капли и микроскопируют.
Этапы приготовления препарата «раздавленная капля»
На середину обезжиренного предметного стекла нанесите петлей 1-2 капли бульонной культуры.
Осторожно покройте каплю чистым покровным стеклом.
Микроскопируйте с приспущенным конденсором. Используйте объективы с увеличением 40 х.
Можно также использовать иммерсионный объектив 100х, нанося на покровное стекло одну каплю иммерсионного масла.
При исследовании живых бактерий следует отличать активную подвижность у отдельных микроорганизмов, свидетельствующую о наличии у них жгутиков, от пассивного броуновского движения (движение бактерий в одном направлении).
Занятие № 7
Экология микроорганизмов Изучение микрофлоры ротовой полости
Практические навыки, осваиваемые студентами на занятии:
Приготовление мазка из зубного налета, окраска простым методом, микроскопия и зарисовка препарата.
Приготовление мазка из зубного налета
На обезжиренное предметное стекло нанесите петлей каплю физиологического раствора.
В правую руку возьмите деревянную палочку (зубочистку) и проведите ею между зубами и у основания зубов, снимая небольшое количество зубного налета.
Погрузите палочку в каплю физраствора, равномерно распределите зубной налет по стеклу и приготовьте мазок в виде небольшого круга (d2см).
Прожгите в пламени спиртовки конец палочки, потушите и выбросьте ее в урну.
После полного высушивания зафиксируйтемазок.
